Meccanismi molecolari coinvolti nella fertilizzazione umana

La fertilizzazione è un processo fondamentale che implica una sequenza coordinata di interazioni tra i gameti maschili e femminili, da cui origina lo zigote diploide. Nel corso di questo processo, gli spermatozoi che hanno completato in modo efficace la spermatogenesi, la maturazione a livello dell’epididimo e l’attraversamento del tratto genitale femminile, si legano inizialmente alla matrice extracellulare che circonda l’ovocellula, la cosiddetta zona pellucida (ZP). Il legame degli spermatozoi alle glicoproteine della ZP attiva l’esocitosi acrosomiale (AE), che comporta la fusione del citoplasma con le membrane esterne dell’acrosoma ed il rilascio del contenuto dei granuli acrosomiali; tali eventi, associati all’intensa iperattivazione della motilità, agevolano il passaggio degli spermatozoi attraverso la ZP, il che consente loro di raggiungere lo spazio perivitellino, nonché di legarsi ed unirsi alla membrana plasmatica della cellula uovo (oolemma); la testa dello spermatozoo penetra nel citoplasma dell’ovocellula (ooplasma) ed il nucleo del gamete maschile va incontro a decondensazione.

Infine, l’ingresso dello spermatozooinnesca i meccanismi che portano al blocco della
polispermia. Ciascuna di queste fasi è schematicamente riportata nella figura 1.1.
Sebbene negli ultimi 30 anni siano stati identificati alcunidei meccanismi coinvolti nella fertilizzazione dei mammiferi, e basi molecolari dell’interazione spermatozoo–ovulo non sono ancora completamente note. L’inadeguata interazione spermatozoo–ZP ed un’alterazione dell’esocitosi acrosomiale indotta dalla ZP sono considerate le cause principali di mancata fertilizzazione nelle tecniche standard di fertilizzazione in vitro (IVF), impiegate nel trattamento dell’infertilità di coppia, ed il contributo prevalente a questo esito è stato attribuito alle anomalie a carico del gamete maschile (1,2).

La comprensione dei meccanismi molecolari alla base dei processi mediante i quali gli spermatozoi raggiungono, riconoscono, legano e si uniscono alla cellula uovo fornirà nuovi strumenti per migliorare le tecniche attuali di diagnosi e trattamento dell’infertilità maschile, nonché i metodi di regolazione della fertilità maschile.
Il presente capitolo offre una rassegna delle conoscenze finora acquisite riguardo ai meccanismi molecolari coinvolti nella fertilizzazione umana ed alle componenti che prendono parte a tale processo. Per motivi di spazio non è stato possibile elencare la maggior parte delle pubblicazioni originali inerenti a ciascun argomento.
La bibliografia riportata rappresenta essenzialmente una selezione delle review e degli articoli scientifici riguardanti i recenti progressi conseguiti nel campo della riproduzione umana.
I risultati degli studi condotti su modelli animali sono menzionati quando strettamente necessario.
Per informazioni più dettagliate si suggerisce ai lettori di consultare le diverse pubblicazioni redatte da prestigiosi specialisti del settore (3-10).

Trasporto degli spermatozoi nel tratto genitale femminile
Lo sperma umano è eiaculato nella vagina ed entro pochi minuti gli spermatozoi raggiungono la cervice
uterina dopo aver attraversato il muco cervicale.
Quest’ultimo agisce come un filtro nei confronti dello sperma e solo pochi gameti maschili dotati di buona
motilità e normale morfologia penetrano nella cavità uterina; all’interno dell’utero gli spermatozoi sono
sottoposti agli effetti delle contrazioni muscolari e solo poche migliaia di cellule risultano in grado di
raggiungere le tube di Falloppio

Durante il percorso e la permanenza nelle vie genitali femminili, gli spermatozoi
vanno incontro a diverse modificazioni metaboliche e strutturali, complessivamente note come capacitazione, ed acquisiscono uno specifico pattern di motilità detto iperattivazione.
Tali modificazioni preparano i gameti maschili ad essere guidati verso la cellula uovo mediante termotassi e chemiotassi, e sono necessarie affinché si verifichino l’AE ed il passaggio degli spermatozoi attraverso il rivestimento dell’ovocellula (vedere oltre).
La stretta correlazione e le interazioni dinamiche tra gli spermatozoi e le secrezionie/o le cellule del tratto genitale femminile sono essenziali per la regolazione e lo sviluppo della capacità fertilizzante
in vivo dello spermatozoo.
Sebbene lo stoccaggio degli spermatozoi nelle tube uterine, mediato dal legame alle cellule dell’epitelio tubarico, sia stato evidenziato in diverse specie animali, l’esistenza di un serbatoio di spermatozoi all’interno delle tube di Falloppio umane resta da dimostrare (11,12).
Capacitazione degli spermatozoi
Il fatto che sia necessaria la capacitazione affinché gli spermatozoi possano realizzare la fertilizzazione nei
mammiferi è evidenziato circa 60 anni or sono, in maniera indipendente, da Austistato n (13) e Chang (14); tuttavia, la conoscenza dei meccanismi molecolari alla base di questo processo è solo in una fase iniziale. A causa
delle limitazioni di carattere etico e tecnico, la maggior parte degli studi finalizzati alla comprensione degli aspetti fondamentali della capacitazione in vivo sono di tipo sperimentale e le conoscenze acquisite rappresentano il
risultato di evidenze ottenute in vitro.

La capacitazione degli spermatozoi umani inizia quando i gameti maschili attraversano il muco cervicale
ocn la rimozione dei fattori inibitori dal liquido seminale.
Durante l’attraversamento dell’utero e delle tube di Falloppio o la penetrazione nel cumulo ooforo da parte dello
dello spermatozoo si verificano diversi eventi correlati alla capacitazione, che si completa sulla superficie della ZP,
con l’AE (11). Le evidenze indicano che la capacitazione degli spermatozoi è un evento asincrono, e che solo
una limitata percentuale di cellule di un eiaculato (circa il 10% nell’uomo (15) va incontro a tale processo in
un determinato momento; la sostituzione continua della popolazione di gameti maschili capacitati assicurerebbe la
disponibilità di spermatozoi “uovo-responsivi” per un periodo di tempo relativamente protratto.

La capacitazione è stata associata principalmente a:
1) modificazioni della composizione e della fluidità della membrana plasmatica dello spermatozoo;
2) modificazioni delle concentrazioni intracellulari di ioni;
3) produzione di bassi e controllati livelli di specie reattive dell’ossigeno;
4) incremento della fosforilazione delle proteine.
In questa sede è riportata una breve descrizione di ciascuno di questi eventi a carico degli spermatozoi umani; per una trattazione più dettagliata di tale processo riguardante gli spermatozoi dei mammiferi si suggerisce la
consultazione di altre fonti bibliografiche (3,7,11,16,17).
Modificazioni della membrana plasmatica dello spermatozoo
La capacitazione degli spermatozoi è stata associata alla rimozione, all’alterazione ed all’acquisizione di componenti
della membrana plasmatica dei gameti maschili nel corso della loro migrazione nel muco cervicale o durante il
passaggio attraverso l’utero e le tube uterine (11).
Un’importante modificazione correlata alla capacitazione degli spermatozoi consiste nell’eliminazione del colesterolo contenuto nel liquido seminale, che rappresenta il principale inibitore del processo di capacitazione;
come risultato della rimozione del colesterolo si ha una riduzione del rapporto colesterolo/fosfolipidi ed un incremento della fluidità della membrana.

La perdita degli steroli spermatici conduce anche ad una riduzione dell’ordine dei lipidi; tali modificazioni si associano ad un aumento della permeabilità agli ioni e della fosforilazione delle proteine a livello dei residui di tirosina, nonché ad una ridistribuzione delle proteine della superficie cellulare (7,17, 18). In particolare, l’efflusso di colesterolo è stato correlato all’esposizione dei recettori del mannosio sulla superficie
dello spermatozoo (19) che interagirebbero con i residui glucidici delle glicoproteine della ZP (vedere oltre).
Le proteine derivanti dall’epididimo e/o dal liquido seminale, che agiscono stabilizzando la membrana plasmatica e prevenendo l’AE prematura, sono rimosse dalla superficie degli spermatozoi nel corso della capacitazione (20). Altre proteine possono essere smascherate dopo incubazione dei gameti maschili in
condizioni capacitanti, come dimostrato nel caso della proteina di origine epididimale P34H (21). Inoltre, durante
la capacitazione può verificarsi una ridistribuzione proteica; per esempio, la proteina testicolare umana TPX1
è localizzata nella regione acrosomiale degli spermatozoi dell’eiaculato, mentre si riscontra nel segmento equatoriale delle cellule capacitate (22).

Alcune componenti del liquido seminale possono legarsi a specifici recettori degli spermatozoi e regolare
l’espressione della capacità fertilizzante dei gameti maschili. È stato riportato che il “peptide stimolante
la fertilizzazione” (fertilization-promoting peptide-FPP), l’adenosina, la calcitonina e l’angiotensina II stimolano
l’iniziazione della capacitazione modulando l’attività dell’adenilato ciclasi (AC) associata alla membrana attraverso
e, quindi, attraverso i livelli intracellulari di adenosin monofosfato ciclico (cAMP)(23).
Inoltre, è stata descritta l’incorporazione da parte della membrana plasmatica degli spermatozoi di alcune
proteine di origine uterina e tubarica.
Ad esempio, la proteina legante l’acido sialico (SABP) secreta dalle cellule endometriali umane si legherebbe alla testa dello spermatozoo facilitando l’afflusso degli ioni calcio (Ca2+) all’interno
del gamete maschile (24).
Variazione della concentrazione intracellulare degli ioni
Durante il processo di capacitazione degli spermatozoi umani è stato riscontrato un incremento dei livelli
intracellulari degli ioni Ca2+. Si ritiene che il legame di questo catione ad alcune proteine (calmodulina) possa influenzare l’attività di diversi enzimi, quali l’AC solubile o la fosfodiesterasi, modulando la concentrazione intracellulare del cAMP; inoltre, gli ioni Ca2+ potrebbero interagire direttamente con i fosfolipidi di membrana, modificandone la fluidità (16,17,25).
Il signaling del Ca2+ negli spermatozoi umani sarebbe regolato dal rilascio di questo catione dai
depositi intracellulari, nonché dall’attivazione di diversi trasportatori e canali all’interno della membrana plasmatica
dello spermatozoo (26).
La capacitazione è stata messa in relazione anche con l’afflusso di bicarbonato (HCO3 –) e sodio (Na+) all’interno
degli spermatozoi e con la fuoriuscita di potassio (K+) dalla cellule spermatiche. Il risultato dell’ingresso
degli ioni HCO3 -è l’incremento del pH intracellulare; inoltre, il bicarbonato attiverebbe anche l’AC solubile
e, quindi, sarebbe coinvolto nel metabolismo del cAMP.
L’aumento della permeabilità al K+ e la ridotta permeabilità al Na+porterebbe all’iperpolarizzazione della membrana
plasmatica degli spermatozoi; l’iperpolarizzazione sarebbe la condizione essenziale per tornare all’inattivazione dei
canali del Ca2+, lasciando la loro capacità di essere attivati dalla ZP nel corso dell’AE (vedere oltre)(16,17,25,27).
Specie reattive dell’ossigeno

Gli spermatozoi incubati in condizioni aerobiche generano specie reattive dell’ossigeno (ROS), quali l’anione
superossido (O2 –), che si trasforma spontaneamente in perossido di idrogeno (H2O2). Sebbene ad elevate concentrazioni siano dannose per la cellula, le ROS a bassi livelli sono utili allo sviluppo della capacitazione ed alle AE. Le ROS sono prodotte in elevate quantità dai leucociti, ma è stata riportata anche la produzione di O2
-da parte degli spermatozoi come eventi correlato alle fasi precoci della capacitazione (28).
Le ROS regolerebbero gli enzimi coinvolti nella sintesi del cAMP e nella fosforilazione delle proteine (vedere
oltre) (29).
Aumento della fosforilazione delle proteine
Il processo della capacitazione degli spermatozoi è stato associato ad un incremento della fosforilazione
delle proteine a livello dei residui di tirosina; sono stati condotti numerosi studi in diverse specie di mammiferi,
tra cui quella umana (17). La maggior parte delle proteine con i residui di tirosina fosforilati è risultata localizzata in corrispondenza del flagello dello spermatozoo, sebbene sia stata riportata anche la presenza di residui di tirosina fosforilati nelle proteine della testa delle cellule spermatiche (30). In particolare, le proteine A-kinase anchor (AKAP82, pro-AKAP82, AKAP3 e FSP95) nonché la proteina legante il calcio e regolata dalla fosforilazione della tirosina (CABYR) localizzate nella coda degli spermatozoi umani vanno incontro a fosforilazione
dei residui di tirosina durante la capacitazione; queste proteine sono coinvolte nel mantenimento della
motilità degli spermatozoi e, probabilmente, nello sviluppo dell’iperattivazione (vedere oltre) (31–34).
Recenti evidenze hanno dimostrato che la capacitazione degli spermatozoi umani è correlata anche alla fosforilazione dei residui di serina e treonina (35–37), sebbene l’identità delle proteine bersaglio e la loro funzione non siano ancora note. La fosforilazione dei residui di tirosina, serina e treonina è stata associata all’efflusso di colesterolo ed è modulata dalle ROS.

Tuttavia, le relazioni tra queste vie metaboliche di fosforilazione rimangono ignote (17,29,37).
Considerate nel loro insieme, le evidenze sinteticamente descritte indicano la necessità che si verifichino numerose modificazioni a livello della membrane plasmatica degli spermatozoi e l’attivazione di diverse vie metaboliche intracellulari come prerequisito per la reattività acrosomiale.
Sviluppo della motilità iperattivata
Al momento dell’eiaculazione gli spermatozoi mostrano una motilità progressiva attivata, che permette loro di
avanzare lungo le vie genitali femminili. Durante la permanenza nella tuba ovarica o in seguito ad incubazione
in condizioni capacitanti, gli spermatozoi dei mammiferi sono in grado di modificare il tipo di motilità e presentano
un movimento meno progressivo, vigoroso, caratterizzato da un battito flagellare di notevole ampiezza
ed asimmetrico; questo fenomeno è stato identificato con il termine di iperattivazione (38), che risulta associata
alla capacitazione dello spermatozoo; tuttavia, lo sviluppo della motilità iperattivata può essere regolata
da una via metabolica distinta o divergente rispetto a quella che modula l’acquisizione della reattività acrosomiale
(39).
Sebbene per lo sviluppo dell’iperattivazione sia necessario il coinvolgimento dell’ATP e del cAMP, è stato evidenziato che un aumento della concentrazione intracellulare di del Ca2+ è essenziale per l’instaurarsi di questo tipo di motilità, che sarebbe correlata alla fosforilazione di specifiche proteine flagellari (40). Parallelamente alla capacità di andare incontro a capacitazione in vitro, una limitata percentuale di spermatozoi umani sviluppa in maniera sincrona l’iperattivazione [circa il 20% delle cellule (41)], e tale processo è reversibile in quanto può essere “attivato e disattivato” nelle singole cellule (40). La motilità iperattivata potrebbe essere necessaria per il
distacco degli spermatozoi dall’epitelio tubarico, per il raggiungimento del sito di fertilizzazione e per il passaggio attraverso il cumulo ooforo e la ZP (3).

Una descrizione dettagliata delle caratteristiche e della regolazione dell’iperattivazione degli spermatozoi dei mammiferi è riportata in altra sede (3,40,42–44).
Condizioni per ottenere la capacitazione degli spermatozoi umani in vitro
Gli eventi correlati alla capacitazione si possono realizzare in vitro incubando gli spermatozoi per un determinato
periodo di tempo, in condizioni ambientali specifiche ed utilizzato mezzi di coltura ben definiti.
Considerando che il liquido seminale contiene fattori decapacitanti, è necessaria la loro rimozione per ottenere
la capacitazione.
I campioni di sperma sono sottoposti a diluizione o a tecniche di separazione; gli spermatozoi immobili e le cellule
arrotondate sono eliminate, ed in tal modo si ottiene una popolazione di gameti maschili di elevata qualità (45).
La capacitazione è un processo temperatura-dipendente(3). L’incubazione delle cellule spermatiche umane a temperatura corporea si è dimostrata essenziale affinché avvenga la fosforilazione delle proteine a livello dei residui di tirosina, si sviluppi la motilità iperattivata e gli spermatozoi vadano incontro ad AE in risposta agli stimoli fisiologici, dal momento che nessuno di questi eventi si realizza nelle cellule incubate a temperatura ambiente (46).
I mezzi di coltura per gli spermatozoi sono stati formulati in modo da simulare la complessa composizione del liquido tubarico. Essi consistono in soluzioni fisiologiche bilanciate arricchite con appropriate concentrazioni di elettroliti, fonti metaboliche di energia (glucosio, lattato e piruvato) ed un
apporto proteico (albumina).
La composizione ionica dei mezzi di coltura è fondamentale per mantenere la funzione degli spermatozoi.

Sebbene la maggior parte di essi contenga concentrazioni millimolari di ioni Ca2+, i risultati dei nostri studi
hanno dimostrato sia che una concentrazione pari a 0.22 mM di questo catione sono sufficienti a sostenere
lo sviluppo di alcuni eventi correlati alla capacitazione (47), sia che il Ca2+ contenuto nel mezzo di incubazione puòessere sostituito con gli ioni stronzio (Sr2+) (48).
La presenza di HCO3 -e di albumina nel mezzo di coltura è essenziale per promuovere la capacitazione. Lo ione
HCO3 -attiva l’AC solubile, il che si traduce nell’attivazione della protein kinasi A (PKA), mentre l’albumina concorre alla rimozione del colesterolo dalla membrana plasmatica. Tutti questi eventi sono associati alla fosforilazione proteica in corrispondenza dei residui di tirosina (17).
Le condizioni in vitro precedentemente descritte forniscono i fabbisogni minimi atti a consentire che si verifichino
gli eventi correlati alla capacitazione degli spermatozoi. È evidente, tuttavia, che essi non sono in grado di simulare pienamente la complessità dell’ambiente naturale nel quale si verifica la capacitazione.
Nelle condizioni di IVF, l’uovo, le cellule che lo circondano e le loro secrezioni potrebbero fornire, ancorché non ancora identificati, ulteriori fattori necessari agli spermatozoi per sviluppare la loro completa capacità fertilizzante.
Termotassi e chemiotassi degli spermatozoi
Le evidenze indicano che gli spermatozoi dei mammiferi non raggiungono l’ovocellula in maniera casuale ma, al
contrario, seguono dei meccanismi che li guidano verso il gamete femminile.

Oltre alla spinta passiva che gli spermatozoi ricevono dalla contrazione muscolare della tuba uterina, nei mammiferi
sono stati descritti due meccanismi attivi per la guida delle cellule spermatiche, noti come termotassi e chemiotassi.
La termotassi consiste nel movimento degli spermatozoi in direzione di un gradiente termico, mentre la
chemiotassi rappresenta il movimento delle cellule lungo un gradiente di concentrazione chimica (49,50).
È stato dimostrato che gli spermatozoi capacitati di uomo e di coniglio manifestano il fenomeno della termotassi,
dal momento che in vitro sono in grado di registrare una differenza termica di 2 °C e di spostarsi verso la
temperatura maggiore (51). Nei conigli, sono state riscontrate temperature differenti tra la sede di deposito degli spermatozoi (più fredda) e quella della fertilizzazione (più calda); inoltre, è stata evidenziata una differenza termica più elevata dopo l’ovulazione (52).
Allo stato attuale non sono noti né i meccanismi molecolari alla base della termotassi degli spermatozoi, né l’identità dei sensori per la temperatura delle cellule spermatiche.
La chemiotassi è stata descritta per la prima volta in specie marine con fertilizzazione esterna (53); in seguito
questo fenomeno è stato osservato negli anfibi, in animali con fertilizzazione interna, tra cui topi e
conigli, nonché negli esseri umani (50). Molte sostanze presenti nei fluidi tubarici e follicolari sono state proposte
come chemioattrattori dei gameti (50). Inoltre, recenti studi hanno indicato che il bourgeonal è un chemioattrattore per gli spermatozoi umani; tale composto determinerebbe l’attivazione di vie metaboliche di trasduzione del segnale che inducono un incremento delle concentrazioni intracellulari di cAMP e Ca2+ (54).
Questi eventi si tradurrebbero in un battito asimmetrico
del flagello ed in un conseguente cambiamento di direzione del movimento. Alcuni chemioattrattori possono
anche aumentare la frequenza del battito flagellare, che si riflette in un incremento della velocità di spostamento
delle cellule, un fenomeno cui è stato attribuito il termine di chemiocinesi (55).

L’importanza della termotassi e della chemiotassi in vivo rimane da stabilire; tali fenomeni avrebbero la
funzione di reclutare una popolazione selezionata di spermatozoi dotati della capacità di fertilizzare l’ovocellula
(15, 51). È stato proposto che mentre la termotassi potrebbe essere un meccanismo atto a guidare il
gamete maschile dal luogo di deposito al sito di fertilizzazione, la chemiotassi potrebbe rappresentare il
mezzo con cui dirigere gli spermatozoi attraverso il cumulo ooforo fino all’ovocellula (49).